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DNA重亚硫酸盐转化


来源: 生物耗材网    发布日期: 2016-9-13  
  

重亚硫酸盐转化是普遍使用的DNA甲基化分析技术,该方法是将胞嘧啶(cytosine,C)转化为尿嘧啶,而5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine,5mC)保持不变(图1)。重亚硫酸盐法广泛用于基因组DNA特定基因甲基化的分析。

重亚硫酸盐转化法被认为是DNA甲基化分析的“黄金标准”,下游分析方法有:PCR和测序。经重亚硫酸盐处理,未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化,接下来,经PCR放大,尿嘧啶(uracil,U)转换为胸腺嘧啶(thymine,T),而5mC和5hmC重新恢复成C(图2)。因此,该技术能够帮助科研工作者区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶,为DNA甲基化区域提供单核苷酸分辨率的信息。实现全部转化是DNA甲基化研究成功的关键因素,并且还应该减少剧烈的化学反应过程中DNA的降解。

重亚硫酸盐处理后,应用较广的下游分析特定基因DNA甲基化的方法主要有重亚硫酸测序、甲基化特异性PCR(MS-PCR)和甲基化基于的微阵列分析。考虑到下游的应用,应该选择最佳的重亚硫酸盐转化方案以期得到最佳的结果,尤其是转化后片段的尺寸对各种下游分析影响较大。BisulFlash DNA Modification Kit最适合real-time MS-PCR,而销量最好的Methylamp DNA Modification Kit是专为Illumina workflow和下一代测序(next-generation sequencing (NGS))设计。测序前,想在更短时间内得到重亚硫酸盐转化产物,我们推荐使用BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Easy Kit,它能在60分钟内完成转化,并且液体转化试剂更便于使用。

使用高质量的DNA非常重要,尤其是转化过程中的酸性条件会使DNA发生片段化。对于DNA含量低的样品,我们推荐使用Methylamp Whole Cell Bisulfite Modification Kit,它能够直接转化细胞、组织、血液和其他起始材料中的DNA。当处理大量样品时,为节省时间和减少花费,高通量的试剂盒是更好的选择。BisulFlash DNA Bisulfite Conversion Mag-96 Kit是基于磁珠的96孔板的形式,适于流线型高通量分析的试剂盒。

关于重亚硫酸盐转化试剂盒,更多细节请看下表:

 

产品名称

Methylamp DNA Modification Kit

BisulFlash

DNA Bisulfite

Conversion

Easy Kit

BisulFlash

DNA Modification Kit

Methylamp Whole Cell Bisulfite Modification Kit

BisulFlash

DNA Bisulfite Conversion Mag-96 Kit

货号

P-1001

P-1054

P-1026

P-1016

P-1050

研发代码

“Classic”

“Easy”

“Fast”

“Direct”

“High Throughout”

用途

基于化学的DNA重亚硫酸盐转化

简化的基于热反应的DNA重亚硫酸盐转化

快速的基于热反应的DNA重亚硫酸盐转化

直接转化细胞、组织、唾液、尿液或血液中的DNA

基于磁珠的96孔板形式的重亚硫酸盐转化

产品关键词

ŸIllumina工作流程兼容

Ÿ最稳定可靠

Ÿ重亚硫酸盐测序、NGS和各种MSP的理想选择

ŸIllumina工作流程兼容

Ÿ热循环变性

Ÿ液体重亚硫酸盐转化试剂

Ÿ反应快速

Ÿreal-time MSP的理想选择

Ÿ测序最佳选择

Ÿ省略了DNA分离的步骤

ŸDNA含量低样品的理想选择

ŸIllumina工作流程兼容

Ÿ流线型高通量分析

Ÿ专为大量样品或者自动转化设计

起始材料

DNA

DNA

DNA

细胞、组织、血液

DNA

最低DNA用量

50 pg

100 pg

200 pg

100个细胞,1 μl血液

< 10 ng

转化所需总时间

< 2 hours

1 hour

30 minutes

< 3 hours

< 1 hour 20 minutes

洗脱体积

8-20 μl

8-20 μl

10-20 μl

8-20 μl

20 μl

转化效率

99.9%

99.9%

99.9%

99.9%

99.9%

脱磺酸基作用/清除

回收率

> 75%

> 75%

> 75%

> 85%

> 85%

转化后DNA片段尺寸

平均:200-2000 bp

峰值800 bp

平均:200-2000 bp

峰值800 bp

平均:100-400 bp

峰值250 bp

平均:200-2000 bp

峰值800 bp

平均:200-2000 bp

峰值800 bp

储存管

离心管

离心管

离心管

离心管

离心管

图1 重亚硫酸盐处理后胞嘧啶(cytosine)转化为尿嘧啶(uracil)

图2 重亚硫酸盐处理将胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U),5-甲基胞嘧啶(5-mC)保持不变;再经PCR扩增,U转换为胸腺嘧啶(T),而5-mC重新恢复为C,以此可将基因中的C与5-mC区别开。

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